非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳:

1 儀器：垂直系列電泳槽；低、中、高壓電源；恒溫循環(huán)器

2 試劑： 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、 考馬斯亮藍(lán)\硝酸銀、凝膠緩沖液、非變性上樣緩 沖液、Tris堿、甘氨酸等

聚丙烯酰胺凝膠電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 儀器：垂直系列電泳槽；低、中壓電源、恒溫循環(huán)器 2 試劑： 丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺， SDS（ 十二烷基硫 酸鈉）溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8）、0.5MTris- HCl(pH6.8）、TEMED、10%(w/v)過(guò)硫酸胺溶液、SDS- Page上樣緩沖液:（ 0.5M Tris（ pH6.8）緩沖液、甘油、 10%SDS 、二硫蘇糖醇、溴酚藍(lán)）、Tris、甘氨酸、SDS 、考馬斯亮藍(lán) \硝酸銀等

SDS-Page，在蛋白質(zhì)裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT

巰基乙醇或DTT可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽分成單個(gè)亞單位。

SDS-PAGE時(shí)，在蛋白質(zhì)裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

PAGE據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)

連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)； 不連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。 不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，利用凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后進(jìn)行分離。

樣品濃縮效應(yīng)

1） 凝膠孔徑的不連續(xù)性： 濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場(chǎng)作用下，樣品顆粒在 大孔膠中泳動(dòng)的阻力小，移動(dòng)速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，受到的阻 力大，移動(dòng)速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓 縮成很窄的區(qū)帶。

2） 電位梯度的不連續(xù)性： 電泳開(kāi)始后，快離子的快速移動(dòng)會(huì)在其后形成一個(gè)離子強(qiáng)度很低 的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶

緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

 

 

 

Tris:緩沖配對(duì)離子，維持溶液的電中性及pH值 Cl-: 在電場(chǎng)中遷移率快，前導(dǎo)離子(leading ion)，快離子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.8的濃縮膠緩沖體系中，甘氨酸解離度很小，因而在 電場(chǎng)中遷移很慢，稱(chēng)為尾隨離子（trailing ion），慢離子。當(dāng)進(jìn)入 pH8.8的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì);因此 Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。高電勢(shì)梯度不存在了，各種蛋 白質(zhì)僅會(huì)由于其分子量或構(gòu)型的不同，在一個(gè)均一的電勢(shì)梯度和pH條件 下通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)所受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動(dòng)率的不同 被分開(kāi) 大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH6.7或8.3時(shí)均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中，都向正極移動(dòng)。

分子篩效應(yīng)

大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 ，這就是分子篩效應(yīng)。

電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同，因而泳動(dòng)率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)率快慢順序排列成一個(gè)一個(gè)區(qū)帶。在進(jìn)入分離膠時(shí)，電荷效應(yīng)仍起作用。 目前，PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣，雖然電泳過(guò)程中無(wú)濃縮效應(yīng)，但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質(zhì)、酶、核酸等活性物質(zhì)變性失活，也顯示了它的優(yōu)越性。

PAGE電泳據(jù)電泳裝置不同分為圓盤(pán)及垂直的板狀兩種

前者凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤(pán)狀，因而稱(chēng)為圓盤(pán)電泳； 后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，故稱(chēng)為垂直板狀電泳。兩者電泳原理完全相同。

蛋白質(zhì)進(jìn)行PAGE時(shí)，常用垂直板電泳。

垂直板電泳的優(yōu)越性有：

表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。

在同一塊膠板上可同時(shí)進(jìn)行10個(gè)以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。

膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。

膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長(zhǎng)期保存與掃描。

可進(jìn)行雙向電泳。