對(duì)于分子量大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成

瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別

瓊脂是由瓊脂糖（agarose）和瓊脂果膠（agaropectin）組成的。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)混合物。它們的結(jié)構(gòu)相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠能力差。 在瓊脂糖制備過程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團(tuán)，就會(huì)造成電內(nèi)滲，電內(nèi)滲對(duì)質(zhì)點(diǎn)的移動(dòng)產(chǎn)生影響。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內(nèi)滲比較小，通常在0.13%以下。 簡(jiǎn)言之，瓊脂糖是從瓊脂中精細(xì)提取的，有自身獨(dú)特的性質(zhì)，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。

瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理

1.DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。

2.DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。

3.DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。

瓊脂糖凝膠電泳

1. 根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1× TAE或0.5×TBE。 注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。

2. 根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。

3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖應(yīng)注意：瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

4.使溶液冷卻至60℃左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻——不提倡使用。 注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴用手套。溴化乙錠在可見光下會(huì)分解。

5.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在5－8 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(>60℃)，會(huì)使得水分 過分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。

6.在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。 注意：凝膠不立即使用時(shí)，用保鮮膜將凝膠包好在4℃下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存2～5 天。

瓊脂糖凝膠電泳

1 儀 器：水平電泳儀、中低壓電泳儀電源、凝膠成像 分析系統(tǒng) 2 配套試劑：

（1）介 質(zhì)：瓊脂糖凝膠

（2）緩沖液：TAE緩沖溶液（Tris堿、乙二胺四乙酸 二鈉二水、冰乙酸） TBE緩沖溶液（ Tris堿、乙二胺四乙酸 二鈉二水、硼酸）

（3）上樣緩沖液： 6×DNA Loading Buffer（DNA樣 品專用包含：EDTA、甘油、二甲苯青 、溴酚藍(lán)）

（4）染 料： EB\ Gelred \ goldview \ GenGreen \ GenView \SYBRGreen等熒光染料

5 耗材： 滅菌的白槍頭、黃槍頭、藍(lán)槍頭、200ul\500ul\1.5ml離 心管等 6 DNA Marker 根據(jù)待測(cè)物分子量來定

瓊脂糖凝膠電泳緩沖液

有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳 Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（TAE) Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE) Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)

瓊脂糖凝膠緩沖液

瓊脂糖凝膠緩沖液

三者之中，TAE的緩沖能力最低，雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%,對(duì)于高分子量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。用于分析復(fù)雜基因組的Southern印跡均用TAE電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。

瓊脂糖凝膠緩沖液

TBE可以使用2-3次左右，而TAE用1-2次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。 電泳緩沖液剛好沒過凝膠1-2mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。

瓊脂糖凝膠上樣緩沖液

上樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的。上樣緩沖液有三個(gè)作用：

1）增加樣品密度；

2）使樣品帶有顏色，便于上樣操作；

3）其中的指示劑在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率 向陽(yáng)極遷移。 上樣緩沖液有幾種，但使用的指示劑基本都包括溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF。

瓊脂糖凝膠上樣緩沖液

溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無關(guān)； 在0.5×TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)的速率約與長(zhǎng)約300bp的線性雙鏈DNA相同，在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì)變化。 含有的甘油可以加大樣品的密度，使其大于TAE的濃度而沉降到點(diǎn)樣孔中，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔